紅色熒光蛋白RFP激發(fā)發(fā)射波長(cháng)和檢測方法

紅色熒光蛋白RFP

紅色熒光蛋白 (red fluorescent protein, RFP) 是一種熒光團，在激發(fā)時(shí)會(huì )發(fā)出紅橙色熒光。人們利用定向誘變技術(shù)開(kāi)發(fā)了幾種變體。最初的變體是從Discosoma中分離出來(lái)的，名為DsRed。紅色熒光蛋白RFP約為25.9kDa。現在，紅色熒光蛋白還有其他變體，它們發(fā)出橙色、紅色和遠紅色熒光。

紅色熒光蛋白RFP是一種多功能生物標記，可用于監測生理過(guò)程、可視化蛋白質(zhì)定位和檢測體內轉基因表達。自12年前發(fā)現個(gè)紅色熒光蛋白DsRed以來(lái)，大量紅移熒光蛋白已被克隆，并通過(guò)生物技術(shù)開(kāi)發(fā)為用于光學(xué)顯微鏡的單體熒光探針。還設計了幾種新型單體RFP，它們會(huì )隨時(shí)間改變發(fā)射波長(cháng)，稱(chēng)為熒光定時(shí)器，或在短暫照射紫光后改變發(fā)射波長(cháng)，稱(chēng)為光激活蛋白。此外，最近還設計?#21496;?#26377;較大斯托克斯熒光發(fā)射偏移的紅色熒光蛋白RFP。

最早被發(fā)現的熒光蛋白是綠色熒光蛋白 (green fluorescent protein, GFP)，已被改造用于識別和開(kāi)發(fā)其他顏色的熒光標記。自從綠色熒光蛋白GFP被克隆以來(lái)，人們從不同生物體中分離得?#20132;?#22312;野生型熒光蛋白的基礎上開(kāi)發(fā)了大量具有實(shí)用價(jià)值的熒光蛋白。在珊瑚蟲(chóng)中發(fā)現了黃色熒光蛋白 (yellow fluorescent protein, YFP) 和青色熒光蛋白 (cyan fluorescent protein, CFP) 等變體。

下圖：愈傷組織中的紅色熒光蛋白RFP表達

紅色熒光蛋白RFP的變體

熒光蛋白的問(wèn)題包括蛋白質(zhì)合成和熒光表達之間的時(shí)間長(cháng)度。紅色熒光蛋白DsRed的成熟時(shí)間約為24小時(shí)，這使得它無(wú)法用于許多在較短時(shí)間內進(jìn)行的實(shí)驗。此外，紅色熒光蛋白DsRed以四聚體形式存在，可影響其所附著(zhù)蛋白質(zhì)的功能。基因工程通過(guò)提高熒光發(fā)展速度和創(chuàng )造單體變體提高了紅色熒光蛋白RFP的實(shí)用性。紅色熒光蛋白RFP的改良變體包括mFruits (mCherry、mOrange、mRaspberry)、mKO、TagRFP、mKate、mRuby、FusionRed、mScarlet和DsRed-Express。

（一）mCherry

mCherry是一種由DsRed的多輪定向進(jìn)化產(chǎn)生的亮紅色單體熒光蛋白。mCherry快速成熟，使其有可能在轉染或轉錄激活后很快看到結果。它具有高度的光穩定性和抗光漂白性。因此，mCherry現在是最廣泛使用和引用的紅色熒光蛋白。mCherry是明亮的紅色熒光蛋白。

（二）DsRed

DsRed單體是標記具有不同功能和/或亞細胞定位模式的蛋白質(zhì)的理想選擇。

（三）tdTomato

tdTomato適合活體動(dòng)物?#19978;?#30740;究。tdTomato是一種特別亮的紅色熒光蛋白，比EGFP亮6倍。tdTomato的發(fā)射波長(cháng)（581nm）和亮度使其成為活體動(dòng)物?#19978;?#30740;究的理想選擇。tdTomato熒光蛋白與mCherry一樣具有光穩定性。Tsien實(shí)驗室通過(guò)定向進(jìn)化將序?#22411;?#35722;引入DsRed的單體變體中，以生產(chǎn)tdTomato。

下圖：紅色熒光蛋白RFP在草莓幼苗的表達

檢測紅色熒光蛋白RFP

紅色熒光蛋白RFP激發(fā)光波長(cháng)峰值為558nm，發(fā)射光波長(cháng)峰值為583nm，需要使用綠光進(jìn)行激發(fā)。

熒光蛋白手電筒GFPfinder-2101GR，又叫紅色熒光蛋白激發(fā)光源，或者紅色熒光蛋白檢測儀。可以高效激發(fā)植物、動(dòng)物和微生物中的各類(lèi)紅色熒光蛋白，例如DsRed, mCherry, tdTomato等。熒光手電筒小巧便攜，可單手使用。既能在實(shí)驗室檢測，也能帶入大棚檢測。高強度激發(fā)光源，黑暗中檢查紅色熒光一目了然！

點(diǎn)擊了解：熒光手電筒GFPfinder-2101GR

下圖：檢測紅色熒光蛋白RFP的熒光手電筒GFPfinder-2101GR

Red fluorescent protein RFP detector