Northern blot中用紫外交聯(lián)儀將RNA與膜交聯(lián)

RNA的膜轉移和交聯(lián)

組織或細胞培養物中mRNA表達的分析通常通過(guò)Northern blot或核糖核酸酶保護測定(ribonuclease protection assay, RPA)進(jìn)行。Northern測定需要先將總RNA在變性瓊脂糖凝膠上分離，然后轉移到膜上并固定以進(jìn)行后續雜交。非同位素RPA利用用修飾核苷酸標記的探針（例如生物素、地高辛、熒光素或合適的半抗原），從變性聚丙烯酰胺凝膠轉移到膜上，通過(guò)二次檢測方案（例如鏈霉親和素/親和素結合物或抗地高辛和抗熒光素抗體）進(jìn)行檢測。

由于這些技術(shù)使用不同類(lèi)型的凝膠，因此每種情況下的轉移方式都不同。瓊脂糖凝膠用于Northern blot，?#39511;?#23427;們具有廣泛的分辨能力和較大的負載能力。它們的多孔性允許核酸?#34892;?#22320;被動(dòng)轉移到膜上。聚丙烯酰胺凝膠的特點(diǎn)是分辨率更高，但負載能力較低。聚丙烯酰胺凝膠基質(zhì)的性質(zhì)不允許通過(guò)被動(dòng)擴散進(jìn)行?#34892;?#36681;移，因此改用電印跡法。

市面上有多種膜適合用于RNA分析，它們由不同的材料組成，并帶有不同的電荷。常見(jiàn)的膜由尼龍和硝化纖維素制成，可能為中性、帶負電或帶正電。尼龍（聚酰胺）膜由最耐用的材料制成，但暴露于有機溶劑中時(shí)會(huì )收縮或彎曲。硝化纖維素在洗滌步驟中容易撕裂，如果烘烤則變得非常脆弱易碎。它也與二次檢測步驟不相容，?#39511;?#34507;白質(zhì)容易吸附到表面，并且不會(huì )特異性地結合探針上的半抗原。中性膜的表面實(shí)際上包含等量的帶正電和帶負電的分?#21360;?#32317;凈電荷為零，但由于正電荷密度較高的區域，可能會(huì )產(chǎn)生斑點(diǎn)狀背景。帶負電的膜提供最干凈的背景，但會(huì )導致較差的特定信號。帶正電的膜提供更好的信號，但它們也會(huì )導致更高的背景。盡管帶正電的膜的信噪比低于其他類(lèi)型的膜，但它們允許的較低水平檢測限彌補了這一缺點(diǎn)。

用紫外交聯(lián)儀進(jìn)行RNA與膜交聯(lián)

有兩種方法可將RNA固定在膜上。一種是傳統的方法，將膜放在80°C的烤箱中烘烤，另一種更常用更高效的方式是，使用紫外交聯(lián)儀XEPU-1208。

使用紫外交聯(lián)儀進(jìn)行RNA膜交聯(lián)的原理是，短波紫外線(xiàn)使RNA中的含氮堿基（主要是尿嘧啶）變?#37238;叨然?#36493;，并與膜表面的胺基形成共價(jià)鍵。潮濕的膜需要大約120mJ/cm2的紫外劑量。上海析浦紫外交聯(lián)儀出廠(chǎng)預設了120mJ/cm2的紫外照射劑量，一鍵即可快速照射。須注意，不要讓RNA暴露在紫外線(xiàn)下不足或過(guò)度，這兩種情況都會(huì )降低雜交信號。通常用254nm短波紫外線(xiàn)照射一分鐘，或用302nm中波紫外線(xiàn)照射三分鐘就足夠了。

紫外交聯(lián)儀XEPU-1208，配有6根254nm紫外燈管，提供穩定、高強度、大面積的紫外輻照。輻照室內面積32x16cm，可容納多組96孔板同時(shí)照射。如果您有關(guān)于northern blot中使用紫外交聯(lián)儀進(jìn)行膜交聯(lián)的任何問(wèn)題，歡迎聯(lián)系上海析浦的工程師獲取技術(shù)支持。

下圖：紫外交聯(lián)儀XEPU-1208，專(zhuān)為膜交聯(lián)設計

UV Crosslinker XEPU-1208 used for crosslinking RNA and membrane